品牌机型：美国BIO-RAD,

实验经验：2014.5-至今，

实验时间：常用7min，10min，经优化也可以3min。

使用心得：当年本小白初来乍到玩的第一个仪器，开始也是一头雾水，眼睁睁看着自己配的常规配方凝胶因为高产热毁掉。根据厂家提供说明书摸索过多种转印缓冲液配方测试效果，体会就是细节决定成败。

仪器介绍：2抽屉设计，分为A槽和B槽（仪器有标记），每槽同时可装1-2块mini protein gel。按键操作，同时仅设置1种程序。主机自带电源，使用时打开开关，30s内自检后可以进行使用。经典转印时间7-10min。商品化kit可以做到3min。

抽屉及三明治结构如图：你只需要记住负极挨着带负电的SDS凝胶，正极挨着带正电的各种膜，上下夹住厚滤纸，所有的核酸、蛋白质转印三明治夹法均一致。

操作流程

01.垂直电泳后，将胶、泡好的pvdf膜、滤纸，放入4℃预先冷却的1*转膜液平衡10min。

02.按照上图顺序铺三明治结构放入转膜槽中，注意保持仪器干燥。

03.锁住转膜槽插入仪器中，开机自检。后进入这个界面。

04.用导航键点选LIST，进入BIO-RAD内置程序。根据需要选择相应程序。也可以任意选择程序后edit运行程序细节。

05.选好后，点RUN。进入程序运行界面，选择插入槽的位置点A RUN或B RUN，开始运行。如中途加入另一转膜槽，则继续点击RUN可以进入上一转膜槽同一程序开始运行。

我的操作心得

01

缓冲液的选择：

①商品化专用5*缓冲液:选用这个注意瓶身有标记使用时如何配比。

1瓶1L,稀释后5L，每个三明治充盈液体大约吸收75ml左右。但进行平衡时尽量多配一些体积，保证浸泡完全均匀，我自己会配500ml，用完后回收。平衡的目的是为了离子强度一致，效果更好。250kD蛋白-10kD蛋白毫无压力。

②自己配缓冲液，我尝试过湿转配方，半干转配方，加乙醇，不加乙醇，加甲醇不加甲醇，各种比例几个配方，个人感觉半干转配方，在自配配方中更好些，但操作稳定性不及商品化转印液（商品化配方更利于新手上手或出于时间成本考量）。具体如下： 

 Tris 

5.82g 

glycine

2.93g

SDS

0.375g（或10%SDS 3.75ml）

甲醇

200ml

以上ddh2o定容至1000ml。

③心得体会：如果有条件尽量买商品化的配方，使用操作时重复性及效果都会比较好。如果是尝试自配配方，尽量多平衡，需要时间上手，反复练习更容易提升重复性。经验是至少200kD-10kD蛋白，若老手操作，可以保证各种转印效果重复性（成功率）90%左右。

02

膜的选择：

不同品牌基本都有印记膜在售。种类上有NC膜，PVDF膜，低荧光背景PVDF膜可选。孔径上有0.45um孔径和0.2um孔径可选；大孔径做大蛋白转印，小孔径做全蛋白（大+小）转印。手感厚的PVDF可以适当增加甲醇活化时间。

03

推荐程序：

①商品化专用5*转膜缓冲液，搭配厂家TGX/TGX stainfree预混液配制凝胶，推荐恒压25V,2.5A,7-10MIN；基础上可摸索。

②自己配缓冲液，搭配普通配方自配胶或者商品化预混液自配胶，我常用的条件是，1胶时恒流1.3A，限压25V，13min；2胶时恒流2.5A，限压25V，13min。基础上可摸索。

③在国内，如果购买商品化产品，建议购买预混合液自己配制凝胶，这样比直接购买伯乐预制胶成本节省约十倍。商品化产品，实验结果更有保障，如全自配，也需要在上述条件基础上进一步优化。