很多老师在做WB的时候，都会碰到一些奇奇怪怪的事情，有些事情可以解释，而有些事情，简直是诡异到摸不着头脑。下面小编给大家整理一些WB中的常见问题，大家一起探讨探讨吧。

Western blot常见问题摘选

1、细胞裂解液主要组分有哪些？SDS、NP-40、TritonX-100有何作用？

答：细胞裂解液一般含有缓冲成分Tris，裂解成分（SDS、NP-40、TritonX-100等），以及蛋白酶抑制剂成分（PMSF等）。

SDS、NP-40、TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。

SDS属于离子型去垢剂，zui厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。

NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉包膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP-40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。

2、Western 及 IP细胞裂解液、RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液的用途？

答：用于普通的Western 、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化，蛋白的Western 检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液（强、中或弱）或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液（强或中）。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液如RIPA裂解液（弱）或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液，例如RIPA裂解液（强、中）或SDS裂解液。

3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理？

答：聚丙烯酰氨凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用的电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，PH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有点和效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为PH6.7的Tris-HCl，分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为PH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是PH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种PH值使不连续体系形成了凝胶孔径、PH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

4、怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？

答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：

1）  电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好。

2）  胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。

5、western blot使用的膜哪种授权啊，PVDF好还是NC膜，如何选择？

答：PVDF膜可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。都可以用丽春红染色。

6、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢固，不易脱落，结果较好。

7、加甲醇的目的是什么？

答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去。（特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱）。

8、我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小的蛋白）不知道有哪些办法？

答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小、时间过短）或过度转移（电压过大、时间过长）的问题，鱼（小分子量）和熊掌（大分子量蛋白）不可兼得。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一点，应该会好一些。

9、Western blot中湿转和半干转的方法区别？

答：半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。

10、半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？

答：可以相等，但是如果膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层滤纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，zui后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般buffer和滤纸选的对就不会短路。

11、丽春红（Ponceau S）染色的原理及特点？

答：丽春红染色（Ponceau S Staining Solution）可以用于PVDF膜、硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜上的蛋白的检测。丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区结合，从而形成红色的条带。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液洗去。

12、如何更高效的监测转膜效率呢？

答：立春红（也包括考染胶）的灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB结果会不会失败（考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染），你仍然得继续后面的操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。

除了立春红染色外，你还可以选择预染Marker来监测你的转膜效率。理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外的操作（固定marker的上样量非常必要）。

13、抗体孵育缓冲液的选择？

答：某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5 – 0.25%)脱脂奶粉或 BSA的封闭液来稀释，可产生相对更强的信号条带。