DNA甲基化是表观遗传的经典修饰方式，其并不改变基因的碱基序列，而是通过改变基因的表达影响细胞的功能，在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用。DNA 甲基化的形式多种多样，主要包括 C5-甲基胞嘧啶（5mC）、N6-甲基腺嘌呤（6mA）等。

目前市场常用重亚硫酸盐法检测5mC，其√确度高，但化学处理会导致DNA分子的片段化、测序深度高、无法鉴定更多修饰类型。Nanopore技术作为新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术，截至目前，全球范围内基于Nanopore平台进行的甲基化研究文章近10篇，见刊于nature methods、bioRxiv等国际知名期刊。

ONT甲基化测序流程

不同于传统的甲基化检测方法，使用ONT平台进行测序前，不需要再对DNA样本进行化学处理，避免了人为因素和化学因素的影响。具体步骤如下：

1、提取高质量基因组 DNA，利用Nanodrop、Qubit 和35% 琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度和完整性质检；

2、将基因组DNA打断成平均8kb左右；

3、使用SQK-LSK109连接试剂盒（ONT官方试剂）进行文库构建，包括DNA 损伤修复和末端修复、接头连接、磁珠纯化等；

4、使用Qubit 进行文库定量。

待文库构建完成后，就可进行上机测序。 ONT 测序是新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术，由于 DNA 链上不同碱基化学性质存在差异，所以当单个碱基通过纳米孔通道时，会产生不同的电信号，而当存在碱基修饰时，同一位置的电信号也会有所差别。基于此，软件则将这些电信号进行识别，判读为不同的修饰信息。

ONT甲基化的优势 

•单碱基水平检测，无中间处理，不扩增、不富集，真实还原碱基修饰信息

•测序读长长，避免短读长带来的拼接比对错误，鉴定z确

•鉴定种类丰富，5mC、6mA多种碱基修饰一次搞定，性价比高

•可进行等位基因特异性甲基化检测