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原代细胞（primary culture cell）

英文名称：primary culture cell

过程：经胰蛋白酶等消化、分散

特点：快慢及难易程度不一

传代：除了部分终末分化的细胞，一般的细胞都能传代6-8代及以上

应用：药敏试验、细胞分化等实验研究

原代细胞(primary cell)是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。

中文名称 原代细胞 英文名称 primary culture cell

特点 快慢及难易程度不一 过程 经胰蛋白酶等消化、分散

传代 除了部分终末分化的细胞，一般可以传代 应用 药敏试验、细胞分化等实验研究

原代细胞定义

原代细胞（primary culture cell）是指从机体的组织（如人组织、小鼠组织大鼠组织和兔组织等）经蛋自酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。原代细胞生长缓慢，一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。

在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

原代细胞是接近和最能反映体内生长特性的细胞，适用于药敏试验、细胞分化等实验研究。

研究中常用的细胞系/株系是现成的，我们只需要进行细胞传代和种子保存。然而，这些细胞系往往因长期体外培养而失去原有的生物学特性，对药物治疗的反应差距越来越大。因此，越来越多的人选择原代细胞。来源于胚胎、组织、器官和外周血，经特殊分离方法制备的原代培养细胞称为原代细胞。原代细胞培养，也称为原代培养，是从供体获得的组织细胞在体外的培养。

动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞，再生长于培养皿中。大多数组织可以制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。肾和睾丸最常用，甲状腺细胞生长较慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性肠胃炎病毒的培养。

这类细胞生命周期有限，在有限的生命周期内需掌握好细胞的生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。

原代细胞的共性

原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA, RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用市场前景广阔。

除了部分终末分化的细胞，一般的细胞都能传代6-8代及以上，有些细胞基至更多，但是一般都建议采用3-4代以内的细胞。

在原代细胞培养过程中，-般是初次培养过夜后换液，以后每隔2-3天换一次液，以培养液的颜色为标准，一般变黄后就需换液。原代细胞的传代前期一般是3-4天传一次代，后期一般是4-6天传一次代(前期指前三代，后期指三代后)。

不同类原代细胞的特性

1.终末分化的细胞

心肌细胞、型肺泡细胞(上皮细胞)、小脑颗粒细胞(神经元)、脂肪细胞、角质形成细胞。终末分化细胞无增殖能力，建议使用新鲜的原代细胞。

2.上皮类细胞

血管内皮、肾小球内皮细胞、气道上皮、结肠直肠上皮、小肠上皮、子宫颈上皮、胰腺导管上皮、肾上皮、肾小管上皮、前列腺上皮、乳腺上皮、甲状腺上皮、角膜上皮细胞等。上皮类细胞大多都能增殖传代6-8代，但多数上皮类细胞的生长伴随着成纤维细胞的大量增殖，3-4 代后成纤维细胞成为优势细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。人体组织来源的上皮类原代细胞增殖能力较弱，建议选用原代细胞进行实验研究。

3.嗅球成鞘细胞

属于神经胶质细胞，可增殖传代，体外培养3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。

4.骨骼肌、平滑肌细胞

可增殖传代，至少10-12代 。

5.成骨细胞、关节软骨细胞

可增殖传代，至少6-8代，但其生长伴随有成纤维细胞的污染，3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。

6.角质细胞、黑素细胞

均取自动物表皮，角质细胞易分化，原代培养6-7天后逐渐分化并死亡。表皮组织中黑素细胞含量较少，原代培养的黑素细胞可增殖传代，至少6-8代，3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。

7.胰岛细胞

可增殖传代，至少8代，但其生长伴随有成纤维细胞的污染，3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。

8.肝细胞

原代培养的肝细胞不易增殖，建议使用新鲜的原代细胞。

原代细胞分离

人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。

1.悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

2.实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

① 机械分散法

特点：简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。

② 消化分离法

组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

Ⅰ酶消化分离法

酶消化分离法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和胶原酶(Sigma/Life)

胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。

除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶

Ⅱ非酶消化法(EDTA消化法)

EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为Ethylenediaminetetraacetic acid。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。

Ⅲ 消化分离法的操作步骤

剪切，加液漂洗，消化，弃去消化液，漂洗，机械分散

Ⅳ 消化分离法的注意事项

组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。

消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，避免膨松的细胞随漂洗而丢失。

原代细胞的培养

原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 [1] 最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞(常用胰蛋白酶)，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖(注意整个过程无菌)。

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

原代细胞的复苏

1.取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。

2.吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。

3.用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2 培养箱静置培养。

原代细胞的培养其实与细胞系的培养无多大差别，针对不同的细胞会选择不同的细胞培养液。

1.培养液选择 

根据不同的细胞类型和实验 要求进行培养液的选择，最常用的L/H DMEM, F12 DMEM, RPMI 1640。

加液：培养液不能浸没组织块，避免组织漂浮。然后培养4h左右加培养液，培养48h后换液。

a.培养时间

无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以 上的时间，期间可换液或者传代。

b.换液时间

无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。

2.细胞状态判断

正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。细胞的状态比较好，生长至80%~90%融合就可以传代。

原代细胞的传代、保存

传一代后的细胞(也可以不传代直接冻存)培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。

冻存液配制:不同的细胞可能会有不同的冻存液配制方案，各实验室也有自己的冻存方案，常见的方案有:

A: 10%DMSO+90%FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMS0+45%DMEM+50%FBS 

按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃ 过夜)→液氮。

D：无血清冻存液

传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。

细胞培养过程无菌操作

正常的复苏，换液和传代操作，最后将培养好的细胞进行相应的实验即可

细胞鉴定

有时候我们获取的原代细胞可能会有不是自己期望的细胞在里面，或者获取的不是我们的目标细胞。这个时候我们需要进行细胞的鉴定。细胞鉴定需要购买特定细胞的表面标志物抗体或者染色试剂进行鉴定。

原代细胞试用的实验类型

原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。在这些应用中几乎都涉及了几个最常见的且最基础的细胞实验，如下:

1.细胞增殖检测

常见检测方法: CCK8检测法，MTT检测法，Brdu检测法， Edu检测法， 平板克隆形成

2.细胞周期检测

常见检测方法:流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法

3.细胞凋亡检测

常见检测方法:流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色， 电镜，TUNEL

4.细胞转移能力检测

常见检测方法:细胞划痕实验，Transwell实验， Invasion实验